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循环游离DNA在结直肠癌诊疗中的应用进展
点击率:77 添加日期:2019-12-06

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结直肠癌(CRC)是常见的消化系统肿瘤之一,近年来其发病率有逐渐上升趋势。研究显示,CRC居我国癌症发病率和病死率的前5位。一直以来,CRC筛查工作以粪便潜血结合结直肠镜为主,但面临内镜诊断流程多、患者依从性差、社区宣教普及困难等缺点。因此,寻找一种能够对CRC进行早期诊断和预后评估的肿瘤标记物刻不容缓。循环游离DNA(cfDNA)是1948年发现的细胞外碎片DNA,主要来自细胞坏死、凋亡。肿瘤细胞释放的cfDNA通常称为循环肿瘤DNA(ctDNA),其中一些能反映肿瘤的特异性特征,包括体细胞突变和异常的DNA甲基化模式,被认为是极具临床运用前景的肿瘤标记物。与组织活检比,检测ctDNA有许多方面的优点:(1)检测方法相对微创;(2)ctDNA能很好地代表患者肿瘤的特征,有很高的特异性;(3)通过动态监测ctDNA定量和定性变化,可实时对患者的疾病复发和******疗效进行判断;(4)检测ctDNA能******地了解肿瘤的遗传学信息,避免组织活检因肿瘤的异质性而漏掉肿瘤部分生物学特征,从而更好地对患者的个体化******提供选择。本文结合国内外关于cfDNA的******研究,对目前检测cfDNA的方法和cfDNA在CRC中的应用进展作一综述。


1.cfDNA检测方法

肿瘤细胞释放的cfDNA占外周血总cfDNA很小一部分,所以需要高敏感性的方法对其进行检测。常用的检测方法包括聚合酶链反应(PCR)和二代测序(NGS)包括全基因组测序和全外显子组测序等。基于实时PCR的检测方法广泛地应用于检测低线(LoD)为0.1%-0.5%的cfDNA测量,但当cfDNA用于检测或监测早期疾病时,ctDNA的比例往往低至0.01%。***近发展出许多基于PCR改进的检测方法,包括基于等位基因定量PCR的Intplex技术,其敏感性范围为0.004%-0.014%,以及乳液PCR技术如微滴式数字PCR(ddPCR)、BEAMing数字PCR等,其敏感性范围为0.001%-0.01%。PCR可对cfDNA中的遗传学改变有较好的检测,但存在每次只能分析少量位点的问题。而运用NGS可以在一次测序中同时对全基因组的遗传学改变进行测量,能显著提高早期CRC患者cfDNA中体细胞突变的鉴定,但全基因组和全外显子组测序的缺点是对于cfDNA的检测分析敏感性很低。新近出现的靶向测序方法,将分子条码和适当的生物信息学筛选步骤与DN****段的深度测序结合起来,从而对其敏感性有所改进。除此之外,还有亚硫酸盐测序法、特异性化学标记法(hmC-Seal)等检测cfDNA中的表观遗传学特点,为cfDNA的检测赋予了更深层次的意义。


2.cfDNA在CRC诊疗中的应用


2.1 cfDNA与CRC的诊断

cfDNA检测有微创性优点,使得这一方法可能成为肿瘤早期筛查的新手段。大量研究表明,cfDNA水平的增高可能提示肿瘤的发生,不过cfDNA不仅来源于肿瘤细胞,也来自正常细胞的坏死和凋亡,故在循环中含量很低,易受多种因素影响。特别是当处于早期疾病时cfDNA的含量更低,所以利用cfDNA水平进行CRC筛查的敏感度和特异度都较低。Kopreski等在8例CRC患者中成功检测到其中5个KRAS突变的存在,但也在170个正常的没有肿瘤表现的个体中检测到37个有KRAS突变变化。与肿瘤相关的基因突变在少部分正常个体中也能被检测到,有些研究发现来自健康个体的样本中有0.45%-20%的cfDNA存在基因突变,尤其是TP53和KRAS突变,但结合甲基化水平能够提升cfDNA的敏感度和特异度。

甲基化是表观遗传学的一种改变形式,在2004年,Belinsky指出超甲基化可能是癌症发生和进展的关键因素。血浆cfDNA甲基化特征的检测相比cfDNA的定量和肿瘤特异基因突变水平,对肿瘤的早期诊断有更高的特异性。Liu等对68例终止******的常见晚期癌症患者血浆cfDNA中9 223个持续超甲基化CpG位点进行了******的靶向甲基化测序,并以此进行甲基化评分,成功检测出57例患者癌症的存在且准确分辨出45个的潜在肿瘤类型,其中,甲基化评分对于CRC探测和分类的准确度******,分别为96.3%、88.5%。

甲基化模式于肿瘤病理的早期出现,而且在CRC肿瘤中表现突出,这些特点都使得它对CRC的筛查有着重要的意义。血浆中的循环SEPT9 DNA是目前对于诊断CRC的一种研究较多的甲基化标记物。Church等进行了一个大型的前瞻性研究,评估循环甲基化SEPT9 DNA在筛查人群中检测CRC的准确性。他们纳入了7900例计划做内窥镜的参与者,发现其中53例CRC患者,循环甲基化SEPT9 DNA在筛查人群中检测CRC的敏感度和特异度分别为48.2%、91.5%,检测晚期腺瘤的敏感度为11.2%。上述结果显示,血浆中的循环SEPT9 DNA是CRC的潜在肿瘤标记物。类似基于甲基化cfDNA的研究众多:如IKZF1/BCAT1、NPY/WIF-1、ALX4、APC、SFRP2、SDC2等。结合多个甲基化生物标记物能提高cfDNA对CRC的早期诊断能力,但这仍需要更多的临床研究证明和敏感度更高的检测技术支持。

此外,DNA的羟甲基化也是表观遗传学的重要组成部分。5-羟甲基胞嘧啶不仅是主动去甲基化过程中的中间媒介,而且作为一个稳定的DNA标记,在肿瘤的早期诊断中发挥着至关重要的作用。已有研究发现,通过CRC患者和健康对照者血浆中5hmC的差异信号,能很好地分辨出CRC患者,利于CRC的早期诊断。总的来说,通过追踪cfDNA中的表观遗传修饰特点,我们可以进一步追溯该异常cfDNA的来源组织,从而实现对于CRC及其转移的早期诊断。


2.2 cfDNA与CRC的疗效评价

肿瘤的异质性一直是肿瘤******研究难以攻克的大难关,使得很多************无法达到预期效果。cfDNA的动态变化为肿瘤异质性和肿瘤进展评估提供了更便捷的方法,并且在时间上比常用的影像学方法能更早地判断******效果。de Figueiredo Barros等分别检测了组织样本(原发和转移性)和血浆样本中5个肿瘤相关基因突变,血浆样本检测到的突变种类明显多于组织样本。同时,血浆样本中ctDNA突变频率也随着化疗进行而变化。在******期间,计算机断层扫描(CT)对于疾病进展的预测明显晚于ctDNA。在Janku等的研究中,通过相关性分析,表明经历全身******患者中cfDNA VAF的变化与对放疗反应呈正相关。

cfDNA中的异常甲基化模式也可用来评估CRC患者的******疗效。Bhangu等的研究纳入34例肝切除术前接受新辅助化疗******的CRC肝转移患者,并收集患者基线及每次新辅助化疗周期前外周血血浆,分析48个CRC相关基因的异常甲基化。他们发现甲基化标志物水平与肿瘤基线体积和******反应相关,且具有较高的敏感度和特异度,通过对CRC相关性甲基化标记物的连续测量,可能对于接受新辅助化疗的CRC肝转移患者的早期疗效评估有一定价值。


2.3 cfDNA与CRC的预后

在cfDNA中,部分肿瘤特异性变异与肿瘤预后有很好的相关性,如KRAS、BRAF等,常被用来检测癌症患者的预后。Perets等用二代测序技术(NGS)对17例转移性胰腺导管癌患者血浆ctDNA进行KRAS突变分析,发现5/17(29.4%)患者血浆KRAS突变,且KRAS突变与更短的生存期相关;Janku等在一项针对55例晚期癌症患者的研究中,用超深下代测序(ul-tradeep NGS)对61个癌症相关基进行突变分析,发现cfDNA变异等位基因频率(VAF)高的患者,比VAF更低者存活时间更久。通过******前后cfDNA中肿瘤特异性遗传学变化,我们可以监测肿瘤的进展可能,预测患者的无肿瘤生存期和选择针对性更强的靶向******,实现精准的个体化******。***近抗肿瘤二、三线******的研究数据表明,检测到cfDNA中KRAS突变的CRC患者对于抗表皮生长因子受体(EGFR)靶向************的疗效很差。Wong等的实验也支持这一观点,他们研究显示,在瑞戈非尼******期间,能在血浆中检测到KRAS突变的CRC患者相比检测不到KRAS突变患者,前者PFS更短。

cfDNA中的耐药突变也可作为监测CRC发展的良好指标之一。有一个研究观察到KRAS突变克隆随******而波动,在进展时KRAS等位基因的改变相对增加,而在EGFR阻滞剂停药后则下降。Bettegowda等对比24例正进行抗EGFR******的转移性CRC患者实体瘤样本,发现其血浆ctDNA中的耐药突变也能检测抗EGFR耐药性。他们不仅检测到了KRAS基因突变,还检测到了在疾病进展时的KRAS扩增,而这些基因变化都可以通过对cfDNA的检测而探测到。利用这些cfDNA改变,我们可以动态地观察肿瘤进化,据此调整******方案,使得患者有更好的疗效和更少的毒性不良反应。

除cfDNA中的肿瘤特异性遗传学变化,cfDNA的总量也被认为是CRC预后判断和发展监测的潜在生物标志物。Bettegowda等的研究首次发现KRAS突变片段的水平和CRC患者更短的总生存时间相关。Bedin等纳入了114例CRC患者,与65例健康受试者和22例腺瘤病灶患者进行预后评估研究,结果显示cfDNA水平升高与预后不良密切相关;一项对2003—2014年发表的包括1022例CRC患者9项研究的分析表明,cfDNA的定量检测可预测无复发生存时间(RFS)和总生存时间(OS)。但由于不同检测cfDNA技术的敏感度和特异度的不同,导致检测出的cfDNA水平也有差异,从而造成对疾病预后的估计有所偏差。***近一个研究将18 F-FDG PET/CT所测得的全身基线代谢活性肿瘤体积与cfDNA基线水平结合起来,对转移性CRC患者的预后也有很好的预测作用。

通过对cfDNA的定量、特异性基因突变和甲基化形式的检测,我们可以将其运用于对CRC早期疾病和******性手术后微小残留灶的检测、复发评估、******疗效和化疗耐药的评价,而这些在目前的研究中已经取得了很多进展。不过,将cfDNA的检测转化为临床应用仍有一定障碍。目前对于cfDNA的检测技术并没有标准化,这使得各个研究所测的cfD-NA结果存在较大差异。我们已经知道cfDNA来源于细胞坏死、凋亡以及少部分细胞的主动释放,但对于cfDNA的来源和生理特征我们理解得并不深入,这些知识和检测技术的发展也是相辅相成的。此外,将cfDNA的检测用于临床还需要建立标准化的分析前程序,包括血浆的收集、获取和储存、cfDNA的抽取等。cfDNA由于自身性质和肿瘤异质性,利用其水平对肿瘤的检测敏感度和特异度并不高,需要发展更灵敏和特异的检测技术和更具特异性的cfDNA特征作为标记物。此外,cfDNA在体内含量低,也存在于健康个体中,不同时期的结直肠癌患者cfDNA检测时间是变化的,这些都为cfDNA的临床价值带来影响。

总的来说,未来仍需要大样本量、前瞻性、多中心随机对照实验来验证cfDNA在CRC诊疗中的作用,并结合多种cfDNA标记物,提高检测的敏感性和特异性。除此之外,我们还应该加强对cfDNA的基础和技术研究,以及早日达到检测技术标准化。随着对cfDNA检测转化为临床应用的更多努力,相信CRC的检测和******监测思路会日益丰富,进一步实现个体化医疗和患者利益的提高,为更多的肿瘤患者带来福音。

节选自:广东医学 2019 年 10 月 第 40 卷第 19 期

肿瘤医学论坛综合整理



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